Генетический скрининг на органоидах раскрыл гены, ответственные за развитие нервной системы человека

Учёные разработали новый способ массовой проверки генов в тканях человека

Наука и космос009 июл 19:48

Исследователи создали метод, который позволяет одновременно анализировать функционирование отдельных генов во всей объёме выращенной человеческой ткани. Эта технология сочетает в себе редактирование генома CRISPR и органоиды — трёхмерные модели мини-органов, созданные на основе человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Новый подход позволил выявить гены, которые имеют критическое значение для формирования нервной системы на ранних этапах эмбрионального развития.

Исследование, опубликованное в журнале eLife, редакция которого назвала эту работу одним из первых значительных исследований, раскрывающих механизмы человеческого развития с использованием моделей эмбрионов, было осуществлено командой, возглавляемой учеными из Гарвардского университета. Подобные эксперименты на человеческом материале ограничены этическими и техническими аспектами, поэтому исследователи использовали органоиды — структуры, способные воспроизводить отдельные этапы формирования тканей в лабораторных условиях.

Основная проблема существующих методов генетического анализа органоидов заключается в неравномерности изменений. При попытке отключить конкретный ген лишь часть клеток получает нужную модификацию, что приводит к образованию «мозаики» из различных клеточных групп внутри одного органоида. Это затрудняет понимание того, как конкретный ген влияет на развитие всей ткани. Новая технология позволяет подавлять активность отдельных генов сразу во всех клетках органоида.

Для этого команда изменила стандартный процесс подготовки CRISPR-инструментов. Обычно создание необходимой генетической конструкции требует нескольких последовательных этапов с выделением и культивированием отдельных клеточных клонов. Учёные объединили несколько этапов и осуществили строгую очистку ДНК на раннем этапе, что позволило избежать длительного отбора отдельных клонов. Полученные генетические конструкции затем доставлялись в клетки с помощью вирусных векторов.

Дополнительно исследователи оптимизировали производство этих вирусных векторов. Они выявили, что уменьшение объёма питательной среды при культивировании клеток увеличивает выход вирусных частиц, а добавление вируса одновременно с размещением стволовых клеток на питательной поверхности значительно повышает эффективность доставки генетических конструкций. В результате модификацию получали почти все человеческие плюрипотентные стволовые клетки.

Чтобы проверить возможности метода, учёные выбрали 77 генов и создали на их основе органоиды нервной ткани. Особое внимание они уделили процессу формирования нервной трубки — структуры, из которой во время эмбрионального развития образуются головной и спинной мозг. Нарушение этого этапа может привести к анэнцефалии — тяжёлому врождённому дефекту, при котором головной мозг развивается неправильно.

Анализ показал, что подавление трёх генов — ZIC2, SOX11 и ZNF521 — вызывает значительные нарушения в формировании нервной трубки. В органоидах с выключенными ZIC2 и SOX11 нервная пластинка оставалась полностью открытой, тогда как при снижении активности ZNF521 наблюдались множественные участки неправильного закрытия. Дополнительный анализ указал на то, что эти гены регулируют не отдельные процессы, а целые группы других генов, участвующих в развитии нервной системы.

По словам авторов, созданная платформа значительно сокращает время и расходы на масштабные генетические эксперименты и позволяет проводить исследования, которые ранее были практически недоступны для человеческих тканей. Новый подход может помочь в выявлении молекулярных причин врождённых нарушений развития и нахождении потенциальных мишеней для будущих методов лечения.

Darth SaharaИсточники:eLifeНаука и космос0Стволовые клеткиCRISPRГеном человекаОрганоидыГенетический скринингЭмбриональное развитие09 июл 19:48