Учёные зафиксировали запуск репликации ДНК в живой клетке и раскрыли механизм расплетения генома

Начальное плавление ДНК зафиксировали с точностью до пары оснований

Учёные впервые детально проследили процесс активации репликации ДНК в живых клетках с точностью до отдельных пар оснований.

Перед делением клетка должна полностью воспроизвести свой геном. Для этого используются специализированные белковые моторы — хеликазы (helicase, от лат. helix — спираль), ферменты, которые разделяют две цепи двойной спирали ДНК. Главный «молекулярный мотор» — хеликаза, расплетающая двойную спираль ДНК на две отдельные цепи перед делением клетки — это комплекс MCM2-7.

Этот комплекс состоит из шести различных белков-субъединиц (от Mcm2 до Mcm7). В своем неактивном состоянии MCM2-7 формирует двойное кольцо вокруг ДНК в определённых точках старта. Ранее исследователи не могли точно зафиксировать в живой клетке момент, когда эти два кольца разделяются, где именно начинается расплетение ДНК и как одна из цепей выходит наружу.

Чтобы пошагово зафиксировать переходный процесс, авторы исследования применили методы химической генетики на клетках дрожжей. С помощью молекулярных защёлок они соединили соседние субъединицы белка Mcm4 одного кольца и Mcm5 другого. Блокировка физического разделения колец привела к прекращению клеточного цикла и снижению синтеза ДНК более чем на 70% через 60 минут после выхода из фазы покоя G1.

Это продемонстрировало, что механический разрыв двойного кольца (гексамера) является необходимым условием для своевременного высвобождения белков-активаторов Sld3 и Mcm10.

Исследование всех шести потенциальных интерфейсов белкового кольца показало, что роль молекулярных ворот для выхода одной из цепей ДНК выполняет стык субъединиц Mcm2/5. Блокировка этого участка позволяет осуществить начальное плавление молекулы, но полностью останавливает дальнейшую элонгацию (продление синтеза), так как две активированные хеликазы физически не могут пройти мимо друг друга с закрытыми воротами.

Нарушение функционирования этого интерфейса оказалось летальным для клеток.

Используя методы геномного картирования высочайшего разрешения (ChIP-Exo 5.0 и PIP-seq), исследователи установили, что первичное расплетение спирали начинается ровно в центре — в точке контакта двух белковых колец. Структура ДНК в этом месте организована особым образом: её плотный центральный участок окружён фрагментами, которые легко поддаются разрыву. Из-за такой архитектуры спираль быстро деформируется и расщепляется под физическим давлением белкового мотора.

Анализ одноцепочечной ДНК показал появление первых расплетённых участков через 15 минут после перехода клеток в фазу синтеза ДНК. Авторы работы проследили, как область контакта белка с ДНК расширяется с 64 пар оснований до промежуточных значений в 72 пары оснований и затем до 138 пар оснований при разделении колец и привлечении ферментов-полимераз.

Исследование впервые объединило разрозненные шаги активации копирования ДНК в единую поэтапную карту: от расхождения белковых колец и выталкивания одиночной нити через молекулярные ворота до разделения копирующих комплексов в разные стороны. Поскольку эти основные белки устроены одинаково у дрожжей и человека, понимание точной механики процесса позволит выяснить, как клетки сохраняют стабильность генома и почему сбои на этапе удвоения ДНК приводят к опасным мутациям.